研究背景：當(dāng)前測(cè)定食品還原糖廣泛使用的測(cè)定方法主要有3,5-二硝基水楊酸(DNS)法、葡萄糖氧化酶/過(guò)氧化物酶試劑盒(GOPOD)法和熒光輔助糖電泳(FACE)法，其中NDS法和GOPOD法具有快速便捷、價(jià)格低、易操作的優(yōu)點(diǎn)。但有部分從業(yè)人員發(fā)現(xiàn)在嘗試采用DNS法和GOPOD法測(cè)定含茶多酚的還原糖體系時(shí)，茶多酚的存在可能會(huì)干擾還原糖測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。
基于以上因素，本研究選取了表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)、沒(méi)食子酸、原花青素和阿魏酸4種典型酚類(lèi)物質(zhì)(圖1)，分別以單獨(dú)的酚類(lèi)、酚類(lèi)與葡萄糖共混、酚類(lèi)與淀粉酶解物共混體系為樣品，研究酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)DNS法、GOPOD法和FACE法定量測(cè)定還原糖的影響，以期找到適用于多酚共存體系中還原糖的檢測(cè)方法。(結(jié)論見(jiàn)末尾)
一、 酚類(lèi)對(duì)DNS法測(cè)定還原糖含量的影響
DNS法測(cè)定還原糖的本質(zhì)是利用氧化還原反應(yīng)原理，即3,5-二硝基水楊酸的硝基被還原糖還原為氨基顯色，而還原糖被氧化成糖酸(圖2A)。
圖2A 酚類(lèi)參與DNS反應(yīng)示意圖
將單獨(dú)的酚類(lèi)、酚類(lèi)與葡萄糖共混、酚類(lèi)與淀粉酶解物共混體系3類(lèi)不同樣品體系與DNS進(jìn)行顯色反應(yīng)，結(jié)果表明，EGCG、沒(méi)食子酸、原花青素代表的3類(lèi)酚類(lèi)物質(zhì)都會(huì)與DNS發(fā)生顯色反應(yīng)(圖2C)且具有濃度依賴(lài)性(圖2B、圖2D、圖2E)，根據(jù)單色光吸光度具有線(xiàn)性加和特性，因此在線(xiàn)性濃度范圍內(nèi)可通過(guò)調(diào)整試驗(yàn)參比排除酚類(lèi)影響。
二、 酚類(lèi)對(duì)GOPOD法測(cè)定還原糖含量的影響GOPOD法的原理是葡萄糖經(jīng)過(guò)葡萄糖氧化酶作用生成葡萄糖酸和過(guò)氧化氫，過(guò)氧化氫進(jìn)一步在過(guò)氧化酶的作用下，將還原性的4-氨基安替比林與酚偶聯(lián)縮合成紅色的醌亞胺類(lèi)化合物質(zhì)(圖3A)。
圖3A 酚類(lèi)參與GOPOD反應(yīng)的示意圖
采用GOPOD法檢測(cè)EGCG、原花青素、沒(méi)食子酸和阿魏酸分別與葡萄糖共混體系中的還原糖含量，發(fā)現(xiàn)吸光度都會(huì)顯著降低，說(shuō)明4種酚類(lèi)物質(zhì)參與了GOPOD反應(yīng)過(guò)程(圖3B)。而EGCG和原花青素質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，與葡萄糖相比，吸光度顯著增加(P<0.05)，這是由于高濃度EGCG或原花青素與試劑盒反應(yīng)產(chǎn)生懸濁物。因此，GOPOD法并不適用于茶食品中還原糖的直接測(cè)定。
圖3B 酚類(lèi)-葡萄糖混合物與葡萄糖試劑盒反應(yīng)的實(shí)物圖
三、 酚類(lèi)對(duì)FACE法測(cè)定還原糖含量的影響
FACE法的原理是還原糖與ANTS發(fā)生衍生化形成不穩(wěn)定亞胺，然后通過(guò)氰基硼氫化鈉選擇性還原亞胺形成穩(wěn)定胺，再通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠將反應(yīng)樣品電泳分離出不同聚合度的還原糖ANTS衍生物(圖4A)。從原理上推測(cè)，多酚無(wú)醛基不能參與ANTS衍生反應(yīng)。
結(jié)果顯示，F(xiàn)ACE法能分離葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、 麥芽六糖、麥芽七糖、麥芽八糖，并且在4種酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)應(yīng)的泳道上無(wú)熒光條帶，驗(yàn)證了EGCG、沒(méi)食子酸、原花青素、阿魏酸不參與ANTS衍生反應(yīng)(圖5A)。進(jìn)一步采用不同濃度的酚類(lèi)物質(zhì)與淀粉酶解物(低聚還原糖)共混，研究共混樣品的FACE熒光顯色情況，發(fā)現(xiàn)酚類(lèi)-淀粉酶解物的熒光條帶分布及強(qiáng)度與對(duì)照淀粉酶解物無(wú)顯著差異，說(shuō)明酚類(lèi)不影響低聚還原糖的測(cè)定(圖5B、圖5C、圖5D)。因此，采用FACE法測(cè)定還原糖是科學(xué)可行的。與DNS法和GOPOD法相比，F(xiàn)ACE法還可同時(shí)獲得淀粉酶解物中低聚糖的分布情況，有助于闡釋酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)淀粉酶的酶解特性及酶解產(chǎn)物的影響。
四、結(jié)論1. 對(duì)DNS法而言，阿魏酸無(wú)影響，而EGCG、沒(méi)食子酸和原花青素能夠與DNS發(fā)生顯色反應(yīng)且呈濃度線(xiàn)性相關(guān)性，增加了DNS法測(cè)定的吸光度，意味著酚類(lèi)物質(zhì)的存在可能會(huì)使常規(guī)DNS法測(cè)定結(jié)果偏高，建議通過(guò)更換參比進(jìn)行方法改良。2. 對(duì)GOPOD法而言，EGCG、沒(méi)食子酸、原花青素和阿魏酸均能參與酶促反應(yīng)生成顯色物質(zhì)，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏離真值，因此該方法應(yīng)用時(shí)需考慮去除體系中的酚類(lèi)物質(zhì)再測(cè)定還原糖。3. 對(duì)FACE法而言，4種酚類(lèi)物質(zhì)均對(duì)FACE法無(wú)干擾，且FACE法還能同時(shí)獲得低聚還原糖的分布信息，是定量測(cè)定含酚類(lèi)物質(zhì)體系中還原糖含量的良好方法。
本文節(jié)選自《茶葉科學(xué)》2023年第4期，P567-575，《茶多酚對(duì)茶食品中還原糖檢測(cè)方法的影響》，作者：盛政，杜文凱，王崇崇，張博安，張海華*，杜琪珍*。
來(lái)源：中國(guó)茶葉
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